肥胖在西方社会正在达到大流行的程度。它导致卫生保健负担增加，预期寿命减少。肥胖是一种复杂的慢性疾病，涉及数十年的病理生理变化和适应。因此，很难确定在人类中进行这一长期过程的确切机制。为了规避这些问题，有几种替代模型，包括小鼠遗传功能丧失突变、转基因功能获得突变、多基因模型和不同的环境暴露模型。饮食诱导肥胖的小鼠模型已经成为理解高脂肪西方饮食与肥胖发展之间相互作用的最重要的工具之一。饮食诱导的肥胖模型与过去20年里现代社会中高脂肪/高密度食物的日益供应非常相似，这是导致人类肥胖趋势的主要因素。这个模型已经导致了许多关于肥胖中重要信号的发现，如Akt和mTOR。
本章描述了小鼠饮食诱导肥胖模型的方案和测量胰岛素抵抗和敏感性的方案。
1.介绍
肥胖是由于食物摄入量、基础代谢和能量消耗的失衡造成的。在个体水平上，多种内源性或环境原因可能导致肥胖。然而，在大多数情况下，过量的热量摄入和可获得的高能量的食物被认为是导致肥胖症的主要原因。由于肥胖并发症如糖尿病和心血管疾病的并发症通常需要几十年，替代动物模型对于研究肥胖的分子方面及其病理生理影响非常重要。其中一个越来越受到关注的模型是饮食诱导的小鼠肥胖模型。
富含脂肪的食物已被证明会增加不同品系的小鼠和大鼠的体重和糖尿病。在过去的20-30年里，有许多研究描述了动物暴露于高脂肪饮食的反应。一些动物的身体脂肪含量显著增加，而一些动物则通过高脂肪饮食抵抗体重增加（肥胖抵抗）。例如，远系繁殖的SD大鼠在喂食高脂肪饮食时，对肥胖的发展有不同的反应。在小鼠中，与C57BL/6J小鼠相比，A/J小鼠和C57BL/KsJ小鼠对高脂肪饮食具有相对的抗性。B6小鼠是一个特别好的模型，模拟了在肥胖中观察到的人类代谢紊乱，因为当自由采食高脂肪饮食时，这些小鼠会出现肥胖、高胰岛素血症、高血糖和高血压，但当饲喂常规基础饲料时，他们保持正常体重，没有代谢异常。
B6小鼠的代谢异常与人类肥胖进展模式密切相似。虽然2周后体重会有所增加，但体重的增加是逐渐的，4周后变得明显。在16-20周的高脂肪饮食喂养后，与对照组饲料喂养的小鼠相比，小鼠的体重通常会增加20-30%。高脂肪饮食对血糖的影响差异更大，并取决于饮食方案的类型。高血糖通常在高脂饮食后的4周内发生（存疑、应该是血糖波动并不稳定）。空腹血糖的升高通常伴随着空腹胰岛素水平的升高。此时，高胰岛素-正血糖钳夹实验将证明全身胰岛素抵抗。然而，没有可靠的糖尿病发展或发病的预测因素，报道的明显糖尿病的发展是有争议的。然而，16周高脂饮食后，肥胖出现，脂肪细胞增生、肠系膜脂肪沉积、脂肪量增加、糖尿病和高血压。
Akt和mTOR通路整合了一些调节细胞生长和代谢的重要信号。食物摄入激活Akt和mTOR信号在肥胖和胰岛素抵抗中具有重要意义。雷帕霉素抑制Akt和mTOR通路对长寿、脂肪细胞分化和肥胖均有影响。最近的研究表明，s6k1缺陷小鼠和Akt1敲除小鼠可以通过小鼠高脂饮食诱导的肥胖模型来阻止饮食诱导的肥胖。
在使用这种饮食诱导的肥胖模型时，有几个因素也很重要。首先，模型特征的遗传性质和程度以及小鼠背景的差异可能导致不同的表型。例如，AKR/J和DBA/2J小鼠对高脂肪饮食非常敏感，而A/J和Balb/cJ小鼠的抵抗力更强。C57BL/6J小鼠的特征优于其他一些模型。第二，性别通常起着重要的作用。一般来说，雄性小鼠比雌性小鼠更容易受到糖尿病的影响，因此在饮食诱导的肥胖研究中更经常被使用。第三，环境因素很重要，应该加以考虑。肥胖小鼠对应激反应敏感，其环境设置会影响实验结果。因此，笼内放置、小鼠密度、食物质量、小鼠处理、垫料（垫料对实验动物肥胖造模的影响）和小鼠检查频率都会导致实验小鼠肥胖发展的干扰。
2.材料
2.1 小鼠
1、C57BL/6J雄性小鼠，4-6周龄（来自杰克逊实验室）。
2、操作清单(DIO模型) C57BL/6J雄性小鼠（Jackson实验室）（见注1）。
注1. 杰克逊实验室提供各种饮食，可以用来诱发肥胖。例如，C57BL/6J小鼠可以在6周龄时开始喂食60%脂肪供能的高脂肪饮食，而对照组小鼠可以喂食10%脂肪供能的正常饮食。年龄范围为6-26周。他们建立了生理数据库和小鼠清单，可以节省大量的实验时间。在使用这些老鼠时，应该进行一定的护理。首先，应该考虑到运输的影响，因为老鼠在运输过程中会产生应激造成体重下降。在使用小鼠之前，我们通常在实验环境中适应1周。其次，我们通常不会把这些小鼠相互混养。雄性老鼠倾向于打架，这将对它们的体重产生一些影响。
2.2 饮食
1. 10%脂肪供能饮食（标准饮食）（见注2）。
2. 45%脂肪供能饮食(研究饮食，D12451i)。
3. 60%脂肪供能饮食（研究饮食，D12492i）（见注3）
注2. 研究饮食D12450B。它的热量组成是20Kcal%的蛋白质，70Kcal%的碳水化合物和10Kcal%的脂肪。每一克它的成分含有3.85Kcal卡路里，其中包括19毫克的猪油胆固醇和黄色染料。
注3.研究饮食D12492。它的热量组成是20Kcal%的蛋白质，20Kcal%的碳水化合物和60Kcal%的脂肪。每克成分含有5.24Kcal卡路里，包括猪油和蓝色染料中232毫克的胆固醇。它应冷冻储存，可以保存6个月。当考虑到人类的饮食时，60Kcal%的脂肪很少会很实用。然而，为了在更短的时间内诱导小鼠肥胖并促进研究，通常使用60Kcal%的高脂饮食。然而，当筛选药物或基因操纵的影响时，有时它可能需要45Kcal%的脂肪饮食，因为它可能更难预防或逆转这种极端的60Kcal%的饮食的影响。
2.3.葡萄糖和胰岛素试验（为正确表述，就不做翻译了）
1. Dulbecco’s phosphate-buffered saline (D-PBS), 1× Liquid (Gibco 14190-136).
2. NaCl 0.9% sterilized, Baxter IV solutions (Baxter 6E1322).
3. Disposable sterile animal feeding needles, Popper & Sons, 20 G × 1 1/2 in. (VWR 20068-666).
4. Tuberculin syringe with 27 G × 1/2 in. needle (Becton- Dickinson, 309623).
5. Heated hard pad.
6. Clean cages with water bottles.
7. D-(+)-glucose 99.5% (Sigma, G7528).
8. Human insulin: Novolin R, 100 U/ml, 10 ml (NovoNordisk).
9. Scalpel.
10. Mineral oil (Sigma M3516).
11. Paper towels.
12. Ascensia ELITE XL Bayer Glucometer Blood (Bayer).
13. Ascensia ELITE XL test strips (Bayer).
14. Batteries, 3 V Lithium cell (Sigma, B0653).
15. SurePrep™ capillary tubes, 75 mm, self-sealing (Becton Dickinson 420315).
16. MicroWell 96-well polystyrene plates, round bottom (non-treated), sterile (Nunc, Sigma, P4241).
17. 20–200-μl pipette with tips.
18. Insulin (Mouse) Ultrasensitive (Alpco Diagnostics, EIA 80- INSMSU-E10).
19. Titer Plate Shaker (Thermo Scientific EW-51402-10).
20. Multilabel Readers, VICTOR (6) (PerkinElmer).
2.4.血液采集和组织采集（不翻译）
1. 1-ml syringes with 25 G × 5/8 needle (Becton-Dickinson 305122).
2. Microtainer serum separator tubes (BD Diagnostics, 365956).
3. MicroWell 96-well polystyrene plates, round bottom (non-treated), sterile (Nunc, Sigma, P4241).
4. Formalin solution, neutral buffered 10% (Sigma HT501128).
5. 50-ml conical tubes (VWR 21008-178).
6. Rodent restrainer 115 VAC, animal weight range 70–125 g (Harvard apparatus).
3.方法
饮食诱导肥胖模型通常需要16-20周的时间完成实验（图1）。此外，肥胖是一种多器官系统疾病，涉及体重、脂肪组织、葡萄糖代谢、胆固醇水平和炎症标志物的紊乱。因此，实验前设计是实验成功的关键。虽然可以测试多个器官系统，许多参数可以检查，但有预先的实验假设和目标是很重要的。在肥胖的发展过程中，人们可以检查和测量各种各样的参数。然而，不同的假设需要不同的测量和实验方法，在某些情况下，这可能会影响生理参数。对这些差异的详细介绍如下。
3.1 饲养环境
1.将小鼠保持在标准的无病原体条件（SPF级）下，自由食用食物和水，并有规律的12：12光-暗循环。确保严格遵循光-暗周期，因为在暗周期开始后检查小鼠会扰乱小鼠的正常昼夜节律，并影响小鼠的代谢。
2.每个笼子里都应安置相同数量的老鼠（见注4）。
3.每天检查笼子和垫料的情况，但避免检查老鼠太频繁。C57BL/6J小鼠虽然不像其他转基因糖尿病小鼠那样需要频繁更换点来哦，但在肥胖和糖尿病后会出现多尿，小鼠笼子可能也需要更频繁地更换垫料。
4.在实验开始时用耳标或对小鼠进行标记，方便识别，因为这些程序也会影响小鼠的体重和葡萄糖。
5.注意鼠笼附近的环境。噪音、交通或其他干扰会影响体重，并可能会对饮食诱导的肥胖实验造成偏差。
注4. 和许多哺乳动物一样，笼子里的C57BL/6J小鼠也建立了社会等级制度，决定了食物、水、休息地点和交配的分配。笼子里不同的老鼠数量会导致不同的社会行为，并会对肥胖的发展产生影响。
3.2.小鼠的随机化和实验设计
由于即使在小鼠的近交系中也存在个体差异，因此在实验前收集小鼠的基线数据是很重要的。我们测量了同性别和同年龄的小鼠的体重、胫骨长度、空腹血糖。在我们的实验室中，C57BL/6J雄性小鼠的基线空腹血糖范围为40-190mg/dl；我们只采用了空腹血糖在70-130mg/dl之间的小鼠。我们还排除了6周龄时体重低于15克或超过25克的雄性小鼠。长相不佳、牙齿问题或毛发疾病的小鼠也被排除在研究之外。
1.在5周龄时，测量小鼠的体重和胫骨长度。
2.测量基线血糖：将血糖仪条插入血糖仪。带有手套的手抓取老鼠，用另一只手或老鼠约束器约束老鼠。我们通常使用非加热版本的啮齿动物约束器。它是圆柱形的，每一面都有一系列的孔，方便注射或验血。
3.按体重随机分组小鼠，并排除体重极端的小鼠。
4.列出各实验组的血糖水平。
5.排除葡萄糖水平极高的小鼠。
6.执行统计量检查，以确保不存在分组偏差。
3.3.高脂饮食喂养及食物摄入量的测量
1.选择不同的饮食方案。例如，对于C57BL/6J饮食诱导的肥胖模型，我们通常对实验组使用60Kcal%脂肪饮食，对照组使用10Kcal%脂肪饮食，这取决于实验的目的（见注5）。
2.在改变饮食之前测量体重。选择有颗粒完整度好的饮食，消除破碎的食物颗粒或粉末。
3.把食物倒进笼子里，避免把碎片或粉末倒进笼子里，因为它们有时会和多尿小鼠的尿液一起污染垫料，而且这些碎片或粉末也会导致食物摄入量测量的误差。
4.每天观察食物的颜色。这些60%脂肪供能的高脂肪饮食暴露在空气中2-3天后往往会变成变软或者变味。
5.每两天更换饮食，测量食物重量的变化，以测量小鼠的食物摄入量。测量前，尽可能取出垫料上的饲料颗粒，以增加测算的精度。
6.通常会根据需要放更多的食物。我们不在每次测量之间添加新鲜食物，因为这可能导致组之间的差异。随着实验的继续，体重的增长，高脂肪饮食组通常会比对照组有更多的能量摄入量。
7.当肥胖小鼠出现多尿时，可能需要每周更换垫料超过两到三次。确保更换垫料不会在测量食物摄入量时造成错误。
8.在更换垫料的同时，同时进行体重测量（见注6）
注5 来自不同供应商的常规食物可能有不同的成分。卡路里的组成通常是蛋白质20%，脂肪10%，碳水化合物70%。然而，它们的胆固醇、维生素、纤维和脂肪成分可能会有所不同。不同实验之间的一致性是很重要的，所以需要尽可能的与实验目的保持一致选择食物。
注6 老鼠是社会性动物。通常有一些老鼠在笼子里占主导地位，而有些则不是。在测量体重时，我们通常会标记哪些老鼠占主导地位，哪些不是，并在两组之间进行比较，以便更好地了解它们的体重变化。
3.4.尾部取血测量
1.将血糖仪带插入血糖仪。
2.带有手套的手抓取老鼠。用另一只手或老鼠约束器约束老鼠。我们通常使用非加热版本的啮齿动物约束剂。它呈圆柱形，每一边都有一系列的孔，便于注射或血液测试。如果有经验，角度型约束器会更简单。
3.用手术刀尽可能少地割断尾巴。
4.把尾部的一滴血放在血糖仪条上并读取。
5.对于血清或除葡萄糖以外的更多的血液，使用毛细管。如果在毛细管采集过程中血液停止，请向尖端按摩尾巴。
6.如果需要更多的血液，请从眶下区域采集血液。
3.5.葡萄糖耐量试验
准确的葡萄糖耐量测试取决于小鼠的制备。 为了密切模拟葡萄糖耐量测试的人类部分，我们在上午 7:00 到下午 15:00 对小鼠进行禁食。 小鼠在明暗阶段是活跃的，与人类相比，这个禁食期更具生理性。 如果没有适当的禁食，耐受试验后的基线葡萄糖读数和葡萄糖水平将难以解释。在我们的实验室，我们通常通过腹腔注射葡萄糖。 注射更符合剂量和结果。 如果要测试许多老鼠，它也可以节省时间。 但是，它不是生理性的，不能完全与人体葡萄糖耐量试验相比较而忽略葡萄糖对胃肠道的影响。
1、清理笼具内的垫料和食物。 确保垫料中没有食物。 保留水瓶。
2、给老鼠称重。
3、在 PBS 中制备无菌 10% (w/v) 葡萄糖溶液。 葡萄糖将在 10 ml/kg 体积中以 1 g/kg（葡萄糖/体重）的浓度给药。有时，我们会在小鼠患糖尿病之前的实验早期选择 2 g/kg 浓度。 如果小鼠患上糖尿病，2 g/kg 浓度将导致血糖仪中的葡萄糖值无法读取。用葡萄糖溶液预装 1 ml 胰岛素注射器。 去除注射器中的空气。
4、禁食期结束后。 测量基线葡萄糖水平。 用戴手套的手抓取老鼠。 用另一只手或老鼠约束器约束老鼠。 用手术刀尽量少切尾巴。 将一滴血液从尾部滴到血糖仪条上并读取。 记录葡萄糖值。 葡萄糖值的范围是 20–600 mg/dl。 如果血糖仪显示值“Hi”，我们通常用毛细管取血并用 PBS 稀释 2 倍。 实际葡萄糖水平很少达到 1,200 mg/dl，稀释 2 倍通常足以显示准确水平。
5、充分禁食后，给小鼠腹腔注射葡萄糖。 如果小鼠较多，在 15 分钟内无法完成注射，我们通常会与两到三个人一起工作，以避免延长注射时间。
6、分别在 15、30、60 和 90 分钟重复血糖测量。
7、测量结束后，将老鼠放回笼子里并投放食物。
3.6.胰岛素水平测量
血清采集后-20℃保存。样品的冻融、4℃保存或无法保证试剂盒达到室温将导致实验误差。
1、准备试剂。 用 10 份偶联缓冲液稀释偶联物。用 0.6 ml 蒸馏水重新配制胰岛素对照。 用 400 ml 蒸馏水稀释 20 ml 洗涤缓冲液。
2、确保微孔板在打开铝箔袋之前处于室温。为标准、对照和小鼠样品指定微孔板条。
3、将标准品、对照品或小鼠样品各10 μl 加入其各自的孔中。
4. 每孔加入 75 μl 酶结合物，用提供的薄膜密封盘子。
5. 将微孔板置于室温下，以 700-900 rpm 的速度摇动 2 小时。
6. 用洗涤缓冲液洗涤微孔板六次，用洗瓶进行最后一次清洗后，将微孔板倒置并用力敲击吸水纸巾，以去除孔中任何残留的缓冲液和气泡
7、每孔加入 100 μl 底物。8. 在室温下在水平微孔板振荡器上孵育 15 分钟。
9. 将 100 μl 终止溶液移入每个孔中。 轻轻摇动微孔板以停止反应。
10. 用 620–650 nm 的参考波长读取 450 nm 处的吸光度。 添加终止溶液后 30 分钟内读取板。
3.7. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌
我们通常单独进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验和葡萄糖耐量试验。但是，葡萄糖刺激胰岛素分泌试验比较繁琐，需要至少两个人同时进行葡萄糖耐量试验和葡萄糖刺激胰岛素分泌试验。葡萄糖腹腔注射后的峰值胰岛素分泌约为 9-10 分钟。我们通常在葡萄糖注射后 0、5、10、15 和 30 分钟收集样本。葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验损伤是 β 细胞衰竭的关键因素，一些基因操作小鼠可能仅在该试验中显示表型，而不是葡萄糖耐量试验。
1、制备葡萄糖并测量小鼠体重。
2、将基线血液收集到毛细管中。
3、给小鼠注射葡萄糖（1 mg/kg，10 ml/kg 体积）。
4、葡萄糖注射后 5、10、15 和 30 分钟采血。
5、将毛细管置于微量血细胞比容离心机中以 12,000 g 离心 10 分钟。在血清和红细胞之间的水平处切割毛细管。
6、将血清加入微孔板中。样品可以在 –20°C 下冷冻以供以后测量。
7、如前所述测量胰岛素水平
3.8. 胰岛素耐受性测试
胰岛素耐量试验的剂量可能从 1 到 5 U/kg 不等，应考虑到小鼠的体重、糖尿病状况和遗传背景。 在 C57BL/6J 饮食诱导肥胖模型中，我们通常使用 2 U/kg 的胰岛素进行注射。 我们通常在空腹状态下进行胰岛素耐量试验。 但是，如果考虑不同模型的目标分子，有时可以在非禁食条件下进行。
1、执行早上 7:00 到下午 15:00 的禁食。
2、测量小鼠的体重。
3、准备胰岛素和葡萄糖。 用冰镇的无菌 PBS 将胰岛素稀释成 2 U/10 ml。用胰岛素预装注射器并保持在冰上。 准备一种或两种葡萄糖无菌溶液，以防止小鼠低血糖。
4、在胰岛素注射后 0、15、30、60、90 和 120 分钟采血。
5、测量葡萄糖水平并观察小鼠。 如果老鼠生理状态不好，立即注射葡萄糖以避免死亡。
3.9.身体成分测量
随着技术的进步，磁共振成像 (MRI) 和双能 X 射线骨密度扫描 (DEXA) 逐渐取代了用于测量脂肪成分的化学胴体分析。化学胴体曾经被认为是全身成分分析的黄金标准。但它需要牺牲老鼠和费时。对单个小鼠的脂肪组织进行解剖和称重，也可以测量全身脂肪。但是，这种方法不太准确。内脏脂肪的收集可能具有挑战性，因为它通常集成在内部器官中，无法准确解剖。DEXA 的身体成分测量由三个部分组成：脂肪、骨矿物质和瘦软组织。与化学提取方法相比，它显示出脂肪面积百分比与全身脂肪之间的强相关性。无需牺牲小鼠，可用于连续测量。
1、测量动物体重并用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液将小鼠腹膜内麻醉。
2、使用小鼠模型校准骨密度和脂肪含量百分比。
3、将小鼠腹部朝下放在一次性塑料托盘上，以便测量整个小鼠。
4、记录骨矿物质密度、骨矿物质含量、瘦肉量、脂肪量和体脂百分比。
5、使用 PIXImus2 软件分析数据。
3.10 小鼠雷帕霉素治疗
1、将 1 mg 雷帕霉素溶解在 20 μl 乙醇中作为叠加溶液。
2、临用前用林格氏盐溶液进一步稀释溶解的雷帕霉素至终浓度为 1 mg/ml。
3、约束老鼠，露出腹部。
4、准备 25 号针头并用稀释的雷帕霉素填充注射器。
5、对注射部位进行消毒，并将针头以 30° 角向头部插入，位于脐尾侧和中线外侧。
6、每次注射前，请务必在注射前进行抽吸，以免渗入肠道或胆囊。
3.11 小鼠处死、组织和血液的收集
在饮食喂养实验之后，处死小鼠以收集它们的血液、内脏并分析全身成分。组织也将用于进一步分析，包括蛋白质或 RNA 或组织学切片。
与对照小鼠相比，饮食诱导的肥胖模型会导致多器官变化。高脂饮食会导致肝脏脂肪变性，解剖后可以明显观察到脂肪肝的变化。脂肪细胞数量和大小增加。胰岛会变得肥大，然后退化。骨骼肌可能降低了胰岛素敏感性。棕色脂肪可能会出现萎缩或白色脂肪沉积。因此，肥胖是一种全身系统紊乱。尽管某些器官系统比其他系统受到的影响更大，但我们通常会按顺序收集涉及的器官以避免数据丢失。
1、处死前准备好处死板、注射器、eppendorf 管、解剖工具、灌注工具和冰镇 PBS 溶液。
2、标记每个 eppendorf 管以供血清、组织收集或组织学固定。牺牲前填充 3.7% 甲醛或组织裂解缓冲液或 RNA 提取溶液 (Trizol)。
3、根据动物规程和伦理规定，用 CO2 对小鼠实施安乐死。
4、用针将小鼠的四肢固定在解剖板上。
5、在脐部附近水平切开皮肤。
6、去除皮肤和皮下层。
7、通过腹部中线做一个垂直切口，打开腹部。
8、切开胸腔，露出心脏和肺。
9、将针头插入心脏左心室心尖部，缓慢抽血，避免过早抽血。一只小鼠可采集 300–1,000 μl 血液。
10、将血液收集到采血 eppendorf 管中。
11、先收集胰腺，因为它们的 RNA 和蛋白质更容易被胰酶破坏。
12、如果需要，收集心、肺、肝、脾、肾和肠。
13、收集皮下、腹股沟和肠系膜白色脂肪垫。
14、收集背部的棕色脂肪。
15、如果需要，收集大脑。
16、进行组织学或组织分析（见注 7）。
注7 对于白色脂肪组织与组织切片的比较，需要将白色脂肪的多个位置与连续切片进行 20 多张切片进行比较，以获得准确的数据。 我们通常收集棕色脂肪附近的皮下脂肪、腹股沟脂肪、肠系膜脂肪、性腺脂肪和白色脂肪，以全面了解小鼠之间的白色脂肪差异。
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A Mouse Model of Diet-Induced Obesity and Insulin Resistance (1849 downloads )
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