基因敲除小鼠相关血管钙化模型

基因敲除小鼠血管钙化模型是利用转基因技术，把对血管钙化有抑制作用的基因缺失或替换以制备血管钙化的小鼠模型。这种方法排除了饮食和药物诱导血管钙化时所伴随的副作用和复合因素，但是其制备过程复杂，需时长，成本较高。

基质Gla蛋白缺陷小鼠

基质Gla蛋白(MGP)是一种由84个氨基酸残基组成的分子量为14kDa的细胞外基质蛋白，主要在肾脏、心脏、软骨、VSMC、内皮细胞和巨噬细胞等部位表达。

在辅助因子维生素K1的存在下，γ-谷氨酸羧化酶可将无活性的谷氨酸残基羧化为有活性的Gla残基，具有5个Gla残基的MGP与羟基磷灰石具有高度亲和力，可抑制钙沉积及羟基磷灰石晶体增长从而抑制血管钙化。

Robicsek等发现MGP小鼠可产生广泛的动脉弹力层钙化，包括主动脉及其大的分支、所有弹性动脉和肌肉动脉，同时冠状动脉内弹力层和气管、小支气管软骨钙化，伴随主动脉的软骨性化生，表现为软骨性基质Ⅱ型胶原蛋白聚糖的出现。

动脉的管壁僵硬，脆性增大，易于破裂。该模型小鼠出生后1周出现动脉中膜钙化，两周时变化明显，3周时中膜全部钙化，两个月时常因主动脉破裂死亡。

其机制可能是MGP与骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2，BMP-2)相结合阻断了BMP-2的作用，而MGP小鼠不能抑制BMP-2的成骨活性而导致血管钙化的发生。

近来研究还证实，脉管系统中MGP组织特异性敲除的小鼠如果再恢复表达MGP则可阻止血管钙化的发生。

骨保护素缺陷小鼠

骨保护素(oateoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)受体基因超家族的成员，在软骨组织及动脉中均有表达，是一种能在体内外抑制破骨细胞发育的分泌性蛋白。

生理状态下产生的OPG还能维持内皮细胞的生存，降低血管对骨质的重吸收。

Bucay等制备的OPG小鼠出现总的骨密度的下降和骨折发生率的升高，同时产生动脉内膜和中膜的钙化，在两周时出现，两个月时最为明显，但没有MGP小鼠动脉钙化范围广泛，钙化主要发生在主动脉和肾动脉，在小动脉中不明显，伴有严重的骨质疏松，其病变还可以在内源性OPG产生的部位出现。

由于OPG能通过核因子KB信号途径竞争性抑制骨保护素配体，OPG的缺失使其抑制骨保护素配体的作用消失而产生血管钙化。Orita等副最新发现，6～10周龄的雄性OPG小鼠连续3d注射维生素D3后可见主动脉中膜VSMC胞浆和细胞外基质中严重的钙沉积，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性与主动脉钙化面积呈正相关，但无VSMC凋亡和巨噬细胞浸润。

载脂蛋白E缺陷小鼠

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)分布于乳糜微粒(carrier protein，CM)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)中，能识别低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein  receptor，LDLR)，结合和转运脂质、稳定脂蛋白结构而参与脂蛋白代谢。

载脂蛋白E小鼠在上世纪90年代初期即广泛用于研究高胆固醇血症和As的斑块进展。Qiao等研究发现载脂蛋白E小鼠在As纤维帽形成后即可产生血管钙化，2/3的载脂蛋白E小鼠在正常饮食下同时发生主动脉和冠状动脉的钙化。

在高脂饲料辅助下载脂蛋白E小鼠可出现更为广泛的As和血管钙化。该模型广泛用于研究动脉粥样硬化和血管钙化的发病和治疗。

Massy等发现载脂蛋白E小鼠在慢性肾功能衰竭后期出现的尿毒症症状能加速载脂蛋白内膜以及无动脉粥样硬化的血管中膜的钙化形成。

低密度脂蛋白受体缺陷小鼠

低密度脂蛋白受体广泛分布于肝脏和动脉壁细胞的细胞膜表面，能特异性识别并结合LDL，其主要作用是转运肝脏合成的内源性胆固醇，LDLR缺陷是引起家族性高胆固醇血症的重要原因。

Towler等用普通饮食喂养LDLR小鼠并不能诱导产生肥胖、糖尿病、AS和血管钙化，而给予8-10周龄LDLR小鼠喂养导致糖尿病的高脂高胆固醇饲料(含1.25％的胆固醇和0.5％的胆盐)，则能产生明显的主动脉钙化，表现为促进矿化和成骨分化的同源结构域转录因子Msx2、Msx1以及成骨细胞的基质蛋白-骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达上调，von Kossa染色证明主动脉和动脉外组织中广泛钙沉积，表明导致糖尿病的饮食诱导LDLR小鼠血管钙化是通过启动成骨细胞转录调节过程来实现的。

骨桥蛋白缺陷小鼠

骨桥蛋白(OPN)是一种分泌型糖基化磷酸蛋白，在骨、软骨、肾、蜕膜和胎盘等组织中广泛表达，OPN能与存在于破骨细胞表面的整合素αvβ3受体结合，酸化局部的微环境，使矿物质溶解，抑制羟基磷灰石结晶的生长，并分泌蛋白酶和水解酶，降解胶原和其它的骨基质蛋白，刺激破骨细胞的骨重吸收活性。

OPN抑制血管钙化的作用可能是通过其转录后磷酸化修饰来实现的，未磷酸化的OPN则无此作用。

Speer MY等研究发现OPN小鼠破骨细胞功能异常，导致骨质的丢失，但是血管钙化的发生不明显。然而MGP和OPN基因双敲除的小鼠在4月龄时动脉钙化的程度比单纯MGP小鼠更为严重，组织学检查发现动脉弹力层断裂、血管破裂并形成动脉瘤，同时发现这种双敲小鼠的VSMCs的标志物β-actin丧失，致使VSMC的可塑性下降并转化为成骨样细胞最终导致血管钙化的发生。从主动脉的von-Kossa切片染色和钙化区域的定量分析表明，60周龄OPN载脂蛋白E小鼠比60周龄载脂蛋白E小鼠具有更广泛的钙化面积。

胎球蛋白A缺陷小鼠

胎球蛋白A(Fetuin-A)又称α2-Heremans-Schmid糖蛋白，是一种与矿物质具有高度亲和力的血清蛋白，是羟基磷灰石前体沉积的抑制因子，它可作为调理素促进细胞对细胞外不溶性钙的内吞作用。

用电子显微镜和动态光散射实验观察发现，Fetuin-A能够与钙和磷形成直径为30～150nm的胶质状可溶性复合物从而抑制羟基磷灰石结晶的起始和初期合成，但是对已经形成的结晶体无作用。

Schafer C等用含维生素D3的高钙高磷饮食喂养Fetuin-A。小鼠可自发性地产生严重的小血管、肾小管和肺泡的异位钙化，而有钙化倾向的DBA/2小鼠的Fetuin-A缺失则出现严重的肾、心、肺、皮肤广泛的矿物质的沉积，伴有动脉血压的增高、肾功能衰竭、严重的蛋白尿、继发性甲状旁腺功能亢进症和骨质的减少，但未见大动脉的钙化。这可能与Fetuin-A  DBM2小鼠动脉壁中抑制血管钙化的因子MGP、OPN的mRNA和蛋白水平的上升有关。

Klotho基因缺陷小鼠

Klotho基因是Kuro-o M等于1997年发现的能够抑制衰老的新基因，编码与β-葡萄糖苷酶序列相似的一种膜蛋白，大部分在肾脏和脑组织表达。

Kuro-o等通过插入突变培育成Klotho小鼠，出现与人类相似的以寿命缩短为特征的衰老过程，包括动脉硬化、不孕、皮肤萎缩、骨质疏松和肺气肿，Klotho小鼠于出生后4周就能产生进行性的动脉粥样硬化过程，随后出现中等大小的肌性动脉的中膜钙化及其内膜增厚，肾脏的小动脉也出现广泛的钙化。

Koh N等的研究发现，Klotho基因的缺失与慢性肾功能衰竭病人所出现的高磷血症和肾病性骨营养不良有关。尿毒症期的病人出现衰老、动脉硬化的加速和异位钙化等症状，与Klotho蛋白产生减少而失去其保护作用有关

Smad6基因缺陷小鼠

Smad是转化生长因子β(transforming growth factor，TGF-β)/骨形态发生蛋白(Bone morphogenic protein，BMP)家族信号蛋白，包括8个成员，分别称为Smad1～8。

分为三类：Smadl、2、3、5和8称为受体调节Smad，介导TGF-β超家族的信号；Smad6和7称为抑制性Smad，抑制TGF-β超家族信号的传导；Smad4为协同Smad，是受体调节Smad的协助信号蛋白。

Hruska KA等研究表明BMP2/4能通过激活其下游的Smad1/5调控成骨细胞的分化和促进成骨的作用，而Smad6则通过抑制Smad1/5的活性而抑制所有BMP诱导血管钙化的信号传导通路；此外Smad6还能通过与BMP Ⅰ型受体的相互作用拮抗BMP诱导的成骨作用。

Smad6 小鼠心瓣膜形成障碍，6周时心脏附近的主动脉和肺动脉出现钙化，而且在主动脉的中膜发现软骨的化生和骨小梁结构的形成，可伴有骨髓的成分，与BMP-2介导的软骨内成骨过程相似．但是有Smad6表达的VSMC处的骨形成受到抑制。同时内皮依赖的血管舒张功能下降，股动脉的平均动脉压升高。

碳酸苷酶同功酶Ⅱ(carbonic anhydraseⅡ，CAⅡ)缺陷(CAⅡ)小鼠

碳酸苷酶(carbonic anhydrase，CA)能把二氧化碳(Co2)和水转化成碳酸氢根和氢离子，通过细胞膜上的钠氢交换使氢分泌到细胞外，从而调节二氧化碳转运、pH稳态、骨的重吸收和尿素的生成等。

Whyte等发现CAⅡ是碳酸苷酶家系的催化活性最强的同功酶，广泛分布于哺乳动物的骨、肾、脑等各组织细胞及红细胞胞浆内，尤以破骨细胞中含量最丰富。遗传学研究表明，CAⅡ缺陷是一种常染色体隐性遗传病，临床表现为骨硬化症、肾小管性酸中毒以及大脑的钙化。由于骨的重吸收需要酸性的微环境，而破骨细胞中碳酸苷酶同功酶Ⅱ缺陷后，丧失形成氢离子的能力，失去了骨重吸收所需的酸性微环境，因此CAⅡ小鼠出现骨硬化症和血管钙化。

Spicer等观察到CAⅡ一小鼠大部分器官的小动脉及其分支的中膜均发生钙化，这种血管钙化与年龄的增长呈正相关，雄性比雌性严重，生殖道动脉壁有广泛的钙盐沉积。

原纤维蛋白1缺陷小鼠

原纤维蛋白1是弹性蛋白相关的细胞外微纤维的主要结构成分，参与弹性蛋白在血管血流动力学稳态的维持，其同源染色体等位基因的突变会破坏局部组织的稳态，诱导显性遗传病Marfan’s综合征的产生，出现主动脉根部的扩张和夹层动脉瘤的破裂。

Pereira等发现6周龄原纤维蛋白缺陷鼠可见血管中膜弹力层的钙化，在弹力层断裂处最为明显，伴有炎性的纤维增生反应和炎症介导的弹性组织溶解。9周时VSMC侵入内膜层并大量增生，弹力层变薄以至破坏消失，胶原、蛋白聚糖和弹力蛋白紊乱。内弹力层的断裂主要是由于内皮细胞的变性和中膜炎症细胞的浸润，外弹力层的破坏则是因炎症细胞和成纤维细胞在邻近外膜的聚集所致，这可能与局灶性的MMP-9过表达降解了弹性蛋白有关。

核苷酸焦磷酸酶／磷酸二酯酶1缺陷小鼠

核苷酸焦磷酸酶／磷酸二酯酶1(ectonucleotide pyrophosphatase／phosphodiesterase Ⅰ，NPP1)能够水解ATP产生焦磷酸，从而抑制羟磷灰石结晶的形成。NPP1表达缺失，焦磷酸的产生受到抑制，则不能抑制基质囊泡中羟基磷灰石结晶的形成，而且丧失其原本具有的局限基质囊泡和拮抗钙化的功能。

先天性NPP1缺失会导致原发性婴儿动脉中层钙化征。Johnson等发现C57BL／6背景的NPP1 小鼠有软骨特异性基因的表达，上调碱性磷酸酶活性，下调生理性钙化抑制剂骨桥蛋白的表达；在主动脉组织内可见到软骨特异性胶原基因的表达，使血管等软组织发生广泛的钙化。

锚蛋白缺陷小鼠

锚蛋白基因最先由HoAM等在2000年发现，定位于5号染色体短臂上，是脊椎动物中普遍存在的一段高度保守的基因序列，编码由492个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白，分子量为54.3kDa，可调节细胞内外焦磷酸盐的水平。焦磷酸盐及其衍生物是软组织钙化的重要抑制因子，锚蛋白能够把细胞内的焦磷酸盐转运到细胞外，通过抑制矿物质的沉积而抑制钙化的发生。

Johnson等报道小鼠Ank基因敲除后产生了广泛的异位钙化，包括心、血管、脑、肝、脾、肺、骨骼肌，同时伴有骨关节炎的发生、骨赘的形成和关节的破坏。但是与NPP-1 小鼠相比，锚蛋白缺陷小鼠的钙化程度要低一些，而锚蛋白和NPP-1双敲除 小鼠则出现更广泛的钙化