实验鼠糖尿病模型建模注意要点

STZ 诱发糖尿病动物模型的原理

STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系：大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型；而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。

造膜前的喂养

Ⅰ型糖尿病模型成模比较快，通常在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模
Ⅱ型糖尿病模型：高脂饮食诱导加相对小剂量STZ。造模前喂以高脂(高糖)饲料，诱发出胰岛素抵抗。

高脂(高糖)饲料

高脂(高糖)饲料成分：其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇

由基础鼠饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比搭配制作高脂高糖饲料：其比例为猪油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黄3 % ,基础饲料59 % 

经验给出：用基础饲料配置时，各个成分不是十分绝对。可以根据动物的口感，做略微调整。比如，增加猪油等，让动物更爱吃。目前该类型的高脂饲料已经有相对稳定、常用的饮食配方可供选用。相关常用高脂饮食介绍：《60%脂肪供能高脂饲料》《45%脂肪供能高脂饲料》

预实验的重要性

很重要。实验时STZ的给药量应参照预实验的结果，尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用，鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同，通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量，才是最科学的。

常用给药剂量

动物的均重(注射时)不同，预实验剂量选取也不同。STZ单位剂量选取上体重成反比关系。

举例（例为鼠/腹腔/一次给药）：

220-250克大鼠重为例 Ⅰ型糖尿病模型：剂量通常为65～50mg/Kg；

Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量通常在35～50mg/Kg；

180-200克大鼠重为例 Ⅰ型糖尿病模型：剂量通常为70～50mg/Kg；

Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量通常在55～40mg/Kg；

25-35克小鼠 Ⅰ型糖尿病模型：剂量为150-200mg/Kg；

Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量在65-100mg/Kg ；

剂量的选取，直接决定成模的效果，本人仅给出一些参考范围，具体剂量的选取，希望大家通过预实验的结果来最终确定。以上数据仅能得出不同重量动物在STZ单位给药量上的关系，即体重越大的动物，单位剂量要适当减少；当然体重大的动物总的STZ耗量仍是高于体重小的。

单次注射和多次注射之间的关系

举例：每次给药50mg/Kg，连续给三次，总剂量为150mg/Kg的方法 与一次给药150mg/Kg方法相比，前者死亡率可能得到缓解，但STZ的对胰岛β细胞的破坏力不如后者（一次给药）来得明显彻底。换句话说，多次注射，可能减少死亡，但一次注射效果明显，如果剂量选取科学，一次注射可以直接到位。建议根据动物品种和抵抗能力，来决定给药次数，目前，大部分用户采用一次注射方法。

分次注射的周期和次数的选取

周期：STZ注射后，药力发挥主要集中在注射后的3-72小时，特别是在前24小时。所以如果采用分次注射，希望在2-72小时内延续第二次注射,目前大部分使用者以24小时为周期居多。

次数：:从1～7次都用人选用过。根据使用这情况大致排序：1次 3次 2次 5次 7次

配置STZ液

柠檬酸缓冲液的配制： 柠檬酸(FW:210.14) 2.1g加入双蒸水100mL中配成A液 柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液

链脲佐菌素配制液：用时将A、B液按一定比例混合（1：1.32也有按1:1的），PH计测定ph值,调节ph=4.2-4.5,即是所需配置STZ的柠檬酸缓冲液。

常见问题

如果我缓冲液配完后PH值不在范围内怎么办？

加溶剂（溶剂皆为偏酸）或加水调节即可。

我的缓冲液可否贮藏再用？

可以。用的时候再次测PH值，保证合乎范围。注意：偏酸性的柠檬酸缓冲液在空气中容易被氧化，所以建议在2-8℃中冷藏，同时不建议存放10天以上，最好现用现配比。

如果PH值不在要求的4.2-4.5之间怎么办？

配置后或存放的缓冲液，如发现偏酸和偏碱，分别用水和溶质来调剂即可。

缓冲液是否需要过滤和灭菌？

必须过滤。柠檬酸/柠檬酸钠为普通的化学试剂，内有杂质影响动物对STZ的吸收。特别是直接静脉注射，严格要求过滤。

关于灭菌

目前没有发现是否灭菌对实验的影响，我们主张是，如果条件允许，采用静脉注射的使用者最好灭菌，而腹腔注射的用户可以不做灭菌处理。

注射时用柠檬酸缓冲液以1%的浓度溶解STZ，按空腹体重注射相应的STZ， 在30分钟内注射完毕。★ STZ容易潮解失活, STZ快速称取后仍严格要求干燥，推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸或干燥的称量纸。 

能否使用其他溶液配置缓冲液

可以。但我们推荐使用柠檬酸。例如用醋酸等溶液，也可以做出，但其PH值不好控制，而STZ只有在PH4.2-4.5的时候才具有最佳药力活性。

禁食和血糖的联系

禁食12小时以上(一般过夜禁食，不禁水)。禁食的时间越长，STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显，即药效越高。所以相对禁食时间延长，可以降低STZ的用量。

腹腔注射和尾部注射的区别

尾部注射即静脉注射，药物利用率较高，同比腹腔注射，可节省药量，缺点是操作起来不如腹腔注射方便。

注射前有那些操作步骤？

过夜禁食后称重，按大鼠总重量比称取STZ，放一干燥灭菌瓶内，外用锡纸包好，将柠檬酸缓冲液及装STZ的瓶子置冰浴（此时未溶解STZ！），一起带到动物房，如果注射操作技术不熟练,应两组交替注射，建议分组溶解STZ，比如10只或15只鼠/组。确保STZ在溶解后，30分钟内用完（且越快越好）！

注射时，推进速度和血糖的关系

推注的速度快，更容易形成高血糖，推注的速度慢，相对的危险性较低，但也不容易成模，常规操作中多要求快速注射。当然，STZ的剂量是决定血糖高低的主要因素。

成模后饲养问题

调查得出，那些注射剂量准确或者偏高于理想剂量的（部分死亡）,成模后往往能较长时间维持高糖；而那些大部分勉强达标,即部分 “成模”，此时有血糖回落的可能.建议这种情况下，如果想长时间维持高糖状态，建议继续给高脂喂。

死鼠问题的解决

鼠的个体差别和空腹(低血糖)抵抗力的差异而致死亡率的不同，开始死亡率高可能主要是血糖突然升高,鼠不适应,或发生了DKA(即酮症酸中毒)。

首先，一定要保证足够的饮水量(饮水量不足容易导致死鼠);

其次，低血糖和高血糖都会造成死鼠。相应措施分别为补糖和注射胰岛素。

1、补糖法。禁食后的鼠，注射的时候已经处于低血糖状态，直至在注射STZ后的48小时内，死亡的原因都很可能是由于急性低血糖，或低血糖昏迷引起的水电解质紊乱，造模4小时后腹腔注射百分之20的葡萄糖（或者灌胃，但对于已经严重虚弱发蔫的个体，不推荐用灌胃，可能加速致死），可避免因血糖过低死鼠

2、补胰岛素法。对于血糖过高的模型，可补一些中效胰岛素，例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素),每次2–3个单位，过了一周，大鼠一般死亡率就低了； 

再次，防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下，会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足,最好是两路供应;

最后，防止感染。糖尿病大鼠尿量多，垫料潮湿，需要勤换垫料，所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染，特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。

模型不达标者，三天后补注STZ(以25mg-40mg/kg体重剂量腹腔注射)，也很容易成模，或让血糖恢复正常后再常规剂量注射;但要达到理想的效果，往往是恢复到正常状态下重新造模。

STZ的保存方法

2-8℃，干燥避光保存。(注：本品易潮解,如需反复取量过程中，应避免其触水受潮，受潮后30分钟后失效，这和注射时要求其快速注射是一个道理，即其水溶液不稳定）。

多次称取STZ时的操作方法和注意事项

如确实需要多次称取，要严格按照避免受潮的原则操作和存放。

操作方法：操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴，分装后用封口膜密封瓶口，用铝箔纸(或锡箔，即避光)将瓶子包好，装入防潮塑料贴袋中（双层更可取），并2-8℃冷藏，可长期保存。本品保质期为3年半。再次使用时，开启瓶口前应先使瓶口通风干却。

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)对机体组织毒性相对较小，动物存活率高，是目前国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的药物。

STZ的采购渠道（谨慎）

STZ使用比较广泛，很多厂家（实际商）都可以提供，但这里建议通过正规渠道采购相对大厂（sigma等）的产品，可以有效的保证STZ的稳定性，顺利进行建模。（有接触过多位老师建模失败、改换厂家建模成功的情况，不一定是产品问题，但确实大厂更为稳定）