多囊卵巢综合征的小鼠模型介绍

大 、小 鼠生殖周期短、动物易于操作 ，且基因背景相对稳定 。同大鼠相比，一系列的转基因小鼠和基因敲除小鼠能帮 助阐明某种基因在 PCOS病理机制中的作用 ，从而为 PCOS的研究提供有力工具。因此本文列举目前常用的 PCOS小鼠模型 ，并总结了不同模型的生殖与代谢特征 。

一 、 雄激素诱导的 PCOS小鼠模型

高雄激素血症不仅是PCOS患者最为突出的特征之一 ，也在 PCOS的发生发展中起着中心作用 ，影响了患者的生殖和代谢表型。自 1962年 Mahesh和 Greenblatt从 PCOS患者的卵巢中分离出了雄激素以后 ，雄激素就开始用于诱导 PCOS动物模型。雄激素主要包 括三种 ：睾酮 (testosterone，T)，脱 氢表 雄酮 (dehydroepiandrosterone，DHEA)和双氢 睾酮 (dihydrotestosterone，DHT)，其中睾酮的生物活性最强 。

(一 )睾 酮(testosterone，T)

睾酮是一种主要由男性睾丸或者女性卵巢分泌的雄激素，少量睾酮也可由肾上腺的网状带分泌。在体内睾酮会直接作用于雄激素受体 ，或者先转化为DHT然后作用于雄激素受体 ，此外 ，睾酮也能转化成雌二醇作用于雌激素受体从而发挥功能。

睾酮诱导的 PCOS模型主要集中在绵羊、猴子和大鼠(Demissie等．2008)，而不常用于小鼠模型 。在小鼠中，仅有报道在怀孕晚期或新生鼠阶段给予睾酮的研究。

Keisler等发现对怀孕 l3-18天的 NZB／W 母鼠给予 0.75毫克的睾酮后并没有引起子代小鼠卵巢功能的紊乱 ，小鼠卵巢形态正常且有黄体 (Keisler等．1991)。

Edwards 等 (1971)在新生 Swiss小 鼠出生后的前三天里每天给予100微克的睾酮或者丙酸睾酮可以导致小鼠不排卵 、排卵紊乱和卵巢多囊化 (Edwards等．1971)， 但该研究未检测代谢方面的变化。

另外 ，有研究显示对5天大的新生小鼠给予1毫克高剂量的睾酮 ， 小鼠可以在 9周时表现出卵巢多囊化 、黄体缺少和不孕 (Kamijo等．1994)。

以上的方法虽然并不都能够成功诱导出 PCOS的表型，但是新生小鼠注射睾酮后还是表现出了一 些 PCOS生殖方面的特征 ， 比如不排卵和卵巢多囊化等 ，但 缺少代谢方面的数据 。

(二 )脱氢表雄酮 (dehydroepiandrosterone， DHEA)

DHEA是一种主要在肾上腺合成的雄激素 ，大部分DHEA被硫酸化为 DHEA硫酸盐 (DHE- AS)而释放入血 ，因此DHEAS的水平有效地反映出 DHEA的合成 ，研究报道至少 20％ ～30％ PCOS患者血清 中 DHEAS的水平升高 (Goodarzi等．2014)。

Roy等 (1962)首先在 22-23天龄的大鼠中注射 DHEA，连续注射 36天后发现 10和 30毫克／公斤体 重／日的剂量可引起大鼠的卵巢多囊化 。

Motta和他的同事用25天龄的BALB／c小 鼠 ，以每天6毫克／ 100克(DHEA／体重 )的剂量连续注射20天得到 PCOS小鼠模型 。该模型小鼠表现出生殖能力低下 、卵巢多囊化 ，同时卵巢中闭锁卵泡增多 ；多囊化卵泡的膜细胞层变薄 ，颗粒细胞变紧密 ；血液中的雄激素 、雌激素和孕酮水平升高 ，卵巢的前列腺素 E (PGE)水平降低 。小 鼠的体重和空腹血糖 水平正 常 ，但空腹胰岛素水平升高。

Motta等的另一篇文献显示 ：DHEA的处理可导致体重增加 ，胰岛素抵抗等代谢特征，这些相互矛盾的结果可能与实验条件的变化有关。

Motta等还对这种动物模型的免疫系统进行了分析 ，发现 DHEA处理可导致小鼠卵巢T淋巴细胞的浸润增加 ，提示免疫水平的改变可能与 PCOS的发生与发展有一定的关系。

目前有很多关于PCOS患者免疫水平变化的报道 ，包括炎症因子c反应蛋白和可溶性CIM0配体水平的增加等 。 这种炎症状态是非肥胖依赖的，但是与胰岛素抵抗有很强的相关性。胰岛素抵抗导致血糖升高 ，高血糖可以启动和调节巨噬细胞 ，从而引起慢性炎症。 在非肥胖 PCOS患者 中，口服葡萄糖可以上调巨噬细胞NF-B的表达 (Gonzalez等．2005)。

但 PCOS患者的炎症反应与胰岛素抵抗之间的关系复杂 ，还需进一步的研究 。最近的一篇研究指出 ：不同基因背景的小鼠对 DHEA诱导的反应存在一定的差异。

Dowllng等的研究表明DHEA在 C57BL／6J背景下诱导的PCOS小鼠模型比BALB／c背景下诱导的小鼠在代谢方面更接近于PCOS患者，DHEA诱导的C57BL／6J 小鼠表现出一定的糖耐量异常和轻度的体重增加 。 因此他们建议C57BL／6J品系在 PCOS的研究中优于BALB／c品系小 鼠，能够 提供一个更为强大的实验平台。

另有研究指出 ：21天龄的C57BL／6J小鼠用DHEA连续处理 90天并不能诱导出PCOS的表型 ，提示DHEA的处理时间和诱导时程在建立 P- COS小鼠模型时的重要性 。

高脂饲料 (highfatdiet，HFD)不仅可以诱导糖尿病和肥胖 ，而且还可导致卵巢的脂毒性和不孕。因此我们在实验中用 DHEA(6毫 克／100 克)对 25天大的 C57BL／6J雌鼠连续处理 20天时， 同时给予小鼠 60％的高脂饮食。实验结果表明DHEA与HFD的联合应用诱导出了 PCOS的生殖表 型 ，即 ：性周期紊乱 ，多数小鼠的性周期停留在某一个或者两个时期 ，这与 PCOS患者的月经周期紊乱相一致 ；血清中的雄激素水平明显升高 ；形态学检测显示卵巢呈现明显的多囊化 、颗粒细胞层变薄 、封闭 卵泡增加、黄体数量减少 ，提示排卵减少或不排卵 。 另一方面 ，DHEA加HFD诱导的小鼠体重明显增加，与临床上PCOS患者多伴有肥胖相对应。胰岛素抵抗一直被视为PCOS患者除高雄激素血症外的另一重要特征和发病因素 ，在 PCOS的发生和发展中都起着至关重要的作用。

DHEA与HFD的联合应用成功地在小鼠中诱导出了胰岛素抵抗和糖耐量异常的表型。同时 ，小鼠还表现出了类 PCOS患者高脂血症 、肝脏脂质的沉积和脂肪细胞增大等现象 。

综上所述 ，用DHEA对25天龄的C57BL／6J雌鼠处理能够诱导出PCOS患者的生殖表型和部分代谢表型 ，如果同时给予HFD处理 ，则能够在此基础上诱导出更多的类 PCOS患者的代谢表型。

(三 )双氢睾酮 (dihydrotestosterone，DHT)

DHT是由睾酮经5or-还原酶催化而产生的一种不能被转化为雌激素的雄激素。

文献报道在小鼠的怀孕 期和青春期两个时期 ，DHT被用于诱导PCOS的动物模型。在母鼠怀孕的第 16～18天给予250微克DHT处理可以导致子代雌性小鼠的生殖功能 紊 乱 。这种产前处理会导致小鼠在成年后表现出性周期紊乱 ，特别是性周期显著延长，而动情期则相对变短；卵巢形态改变 ，小的窦性卵泡增加 ，而黄体缺少 ，卵泡的颗粒细胞层变薄，膜细胞层有轻度的增厚 ，同时小鼠的生殖能力明显降低 ，血清中的睾酮和 LH水平升高 。另一方面 ，产前处理也诱导出了一系列的代谢特征 ，包括空腹血糖升高和糖耐量异常。 这些异常不依赖于年龄 ，却与胰 岛素 的分泌有一定关系。组织分析还显示小鼠的脂肪细胞变大 ，而且肝脏脂质沉积，但是体重和脂肪的重量比未改变。

同时 ，研究者指出这种模型表现出了GnRH神 经元的高反应性 ，GnRH的分泌频率也加快 ，表明高雄激素水平可能改变了类固醇激素的回馈调节信号。

最近的一篇研究显示将含有 2.5毫克 DHT的缓释泵埋人19天龄 的小鼠体内，连续处理 90天后能诱导出与PCOS患者类似的生殖和代谢表型。这种DHT的长期处理导致小鼠的性周期紊乱、黄体缺失等表现 ，卵巢呈多囊样结构 ，同时卵巢中含有大量的闭锁卵泡、囊性空泡的膜细胞层增生、颗粒细胞层变薄 ，但是窦前卵泡和小的窦性卵泡的数量并未增加。卵巢的重量有升高的趋势 ，这与用同样方法处理的大鼠的结果相反 ，研究者认为这可能是与大鼠和小鼠最终的雄激素水平不一致有关 。血清中雄激素水平明显升高，但是LH水平下降。DHT的长期处理还导致小 鼠的体重和脂肪含量增加、脂肪细胞的直径增大 ，以及脂肪因子分泌紊乱 ，其中主要是瘦素水平的降低和脂联素水平的升高。脂肪因子对于代谢和生殖的变化起着重要作用 ，例如瘦素能够诱导LH的分泌 ，同时抑制FSH诱导的芳香酶的表达，所以脂肪因子分泌的改变可能参与了 PCOS的发生和发展过程 。

DHT的长期处理还导致小鼠出现糖耐量异常 ，但是空腹血糖和胰岛素水平并未改变 。DHT作为一种常用的雄激素 ，其诱导 的 PCOS小鼠模型表现出了诸多与临床一致的表型 ，特别是 DHT的长期处理可以使小鼠表现出PCOS的生殖和代谢两个方面的特征。但是 PCOS的许多代谢紊乱 特征 ，比如胰岛素敏感性下降、血脂紊乱 、脂肪肝等尚未在此小鼠模型中报道。此外，该模型的诱导时程为90天 ，模型建立时 鼠约为 3.5月龄 ，年龄也是研究者在选择小鼠模型时针对研究目的应考虑的一个因素。

二、雌激素和来曲唑诱导的PCOS小鼠模型

PCOS小鼠模型除了常用雄激素来诱导外 ，还 有一些其他方法 ，比如用雌激素或芳香酶抑制剂来曲唑来处理小 鼠。

(一)雌激素(estrogens，E)

雌激素是雄激素在颗粒细胞中经芳香化酶 P450催化转变而来的，对 于女性正常的排卵和子宫功能的维持等起重要作 用。有报道指出部分PCOS患者的雌激素水平升高。

雌激素诱导的 PCOS小鼠模型主要利用 5～7 天龄的新生小 鼠 ，通过每天皮下注射20微克的雌激素 ，使小鼠在成年后表现出卵巢多囊化和黄体缺少 。

Chapman等主要对模型中免疫系统和生殖系统的关系进行了探讨 ，发现胸腺切除的小鼠注射雌激素后并不能引起 卵巢多囊化和黄体缺少 ，说明免疫水平的改变与卵巢的形态和功能的变化有关 ，这 一 点也与前面所提及的 DHEA诱导的 PCOS模型中免疫水平发生了改变的结果相一致。然而研究中没有关于激素水平和代谢方面的数据。

(二 )来曲唑

来曲唑(letrozole)是一种芳香酶抑制剂 ，能够阻止雄激素转化为雌激素 ，使内源性的雄激素水平升高 ，因此来曲唑也被用于诱导PCOS的动物模型 。对 21天龄的雌鼠用8毫克来曲唑包埋缓释泵连续处理 90天，可以导致小鼠性周期紊乱 、稀发排卵和卵巢多囊化 ，同时卵巢有囊性出血 ， 但是小鼠并没有表现 出代谢方面的特征 。

三 、基因敲除小鼠和转基因小鼠的PCOS模型

现有研究认为 PCOS具有一定的遗传相关性 ， 但不是单基因遗传 ，而是表现为多基因的相关性 。 转基因动物在研究疾病的发生发展过程中已经成为一种重要的研究手段 ，能够为更好地理解某一基因在疾病发生发展过程的作用提供非常有效的方法 。随着研究的不断深入 ，一些转基 因动物也被报道具有类 PCOS样的表型。

(一 )瘦素缺乏 (ob／ob)和瘦 素受体缺乏 (db／ db)的小鼠

瘦素是一种由脂肪细胞合成和分泌的激素，能够抑制食欲、促进能量消耗、调节代谢。

瘦素水平升高也是PCOS患者的特点之一。由于瘦素可以直接刺激 GnRH的分泌 ，而下丘脑的GnRH分泌异常也是PCOS患者的特征之一 ，所以有文献报道瘦素信号通路的改变可能参与了PCOS的发生发展。ob／ob小 鼠 (Harem 等．2004)和 db／db小 鼠 (Garris等．1989)展示出一系列的类PCOS的生殖和代谢特征 ，如 ：成年的雌性小鼠表现出生殖能力低下 、性周期紊乱 、不排卵、封闭卵泡的数量增加。此 外 ，ob／ob小 鼠血清中的雌激素、雄激素和孕激素水平还明显升高 ，FSH的水平降低 ，但 db／db小鼠的雌激素和孕激素水平都低于正常。同时 ，两种小 鼠都表现出了肥胖 、高血糖 、糖耐量异常和高胰岛素血症等代谢表现。遗憾的是 ，这两种基因敲除小鼠都没有呈现卵巢多囊化 。

(二)阿片-促黑色素皮质神经元 (pro—opiome1 anocortinneurons，POMC)的瘦素受体和胰岛素受体选择性敲除(IR／LepPoMc)小鼠

高胰岛素血症和高雄激素血症是PCOS患者最为常见的症状 ，对 PCOS患者的生殖和代谢表型起着至关重要的作用。下丘脑的POMC神经元是机体调节能量代谢和糖稳态的高级神经中枢 ，胰岛素和瘦素受体在 POMC神经 元中也有较高的表达。下丘脑瘦素受体和胰岛素受体特异性敲除的小鼠(IR／LepP0Mc)表现出明显的代谢紊乱 ，包括基础胰岛素水平升高、糖耐量异常、胰岛素抵抗 、体脂和体重都升高。同时 ，这种小鼠的LH和雄激素水平升高 ，卵巢的形态也发生了改变 ， 与正常小鼠相比有较多的退化卵泡 ，偶尔也能见到囊性卵泡。研究者指出这种小鼠在体 重和脂 肪含量增加的同时也存在轻度的慢性炎症反应 ，这些炎症反应进一步影响了肝脏对糖代谢的调节 、肌肉对胰岛素敏感性 、脂肪功能的紊乱以及卵巢的形态学和功能的变化 。

(三)雌激素受体(estrogenreceptor，ER)α敲除和芳香化酶 (aromatase，CYP19)敲除小鼠

ERα 和 CYP19敲除小鼠的本质都是小鼠体内的雌激素信号通路被破坏 ，所以这两种小鼠有很多相似的表型(Britt等．2000，Couse等．1999)，比如 ：由于缺乏了雌激素的负反馈作用 ，导致LH 的水平升高 ；卵巢表现出囊性出血 、不排卵等。

此外 ，CYP19敲除小 鼠表现出卵泡发育异常 、大量的巨噬细胞和胶原纤维沉积在卵巢 ，而 ERα敲除的小鼠期给予GnRH 拮抗剂后则可以降低LH的水平 ，同时卵巢的多囊化也得到改善 。

(四)过表达人绒毛促性腺激素(human chofionic gonadotrophin，hCG)β亚基和促黄体生成素 (luteotropic hormone，LH)β亚基小鼠

LH分泌增加是PCOS的一个特征。hCG与LH同属一个家族 ， 他们共享一个α亚基 ，并且 二者的受体非常相似 。 过表达 hCGβ或人 LHβ的小鼠表型在某些方面十分相似 (Matzuk等．2003，Risma等．1995)，都表现出排卵能力下降、不孕 、血清雌激素水平升高 、以及卵巢出现多囊化 。hCGβ转基因雌鼠还表现出肾脏和膀胱变大 ，而 LHβ转基因小鼠则有雄激素水平升高 、肥胖 、腹部脂肪的沉积增加 、胰岛素水平升高等代谢表型。

同时 ，LHβ小鼠还存在一些与PCOS无关的表型 ，比如 ：垂体腺瘤 、乳腺囊肿、卵巢肿瘤 、卵巢中黄体数量增加等。

这些结果说明 hCG和 LH有可能参与了PCOS的病因 ，尤其是卵巢多囊化的形成过程 ，但 hCG和 LH PCOS的发生发展中的作用需进一步的研究 。

(五)过表达人纤溶酶原启动物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)小鼠

PAI-1是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一 ，与糖尿病 、心血管疾病等有着密切的关系，常作为心血管和代谢性疾病的分子标志。

纤溶酶系统和卵巢蛋白的动态水解过程有关 ，有数据显示PCOS患者血浆中 PAI-1 的水平升高 。Devin等在小鼠中通过过表达人 PAI- 1，构建 了 PAI-1转基因小鼠。小鼠表现 出许多 PCOS患者生殖方面的特征 ，如 ：不排卵 、黄体缺失 ，而且有 50％以上的雌鼠出现了卵巢多囊化、卵巢膜细胞层增厚 、颗粒细胞层变薄 ，雄激素水平也升高了2 倍左右 (Devin等．2007)。

这些数据表明过量 PAI- 1可能参与了 PCOS的发生发展 ，特别是卵巢形态和功能的改变 ，但小鼠代谢方面的变化不明。

(六 )卵巢过表达神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)的小鼠

交感神经兴奋性增强被认为是 PCOS的发病机制之一 ，肥胖 、高胰岛素血症和阻塞性睡眠呼吸暂停等 PCOS的症状都与交感神经过度兴奋有关 。NGF是一种神经营养因子 ，能够促进卵泡的发育和排卵 ，也是交感神经兴奋的分子标志之一 。在PCOS患者的卵泡流出液和体外培养的 PCOS患者原代颗粒细胞中检测出NGF的含量高于正常对照组 。小鼠卵巢过表达NGF可以导致卵泡在窦性卵泡期出现闭锁 、凋亡增加、小的生长卵泡积累 ，LH水平有轻度的持续性升高，这使卵巢多囊化的几率增加 ，表 明PCOS患者的卵巢形态可能与卵巢NGF的含量有一定关系¨ 。同时 ，过表达 NGF的小鼠还表现出对促性腺激素的高反应性 、青春期延迟和生殖能力降低 。

最近，Wilson等对这种卵巢过表达NGF小鼠(17NF小鼠)的代谢方面进行了检测 ，发现17NF小鼠呈现体重增加、腹部脂肪相对于皮下脂肪分布增加、葡萄糖耐量异常和高胰岛素血症等代谢异常症状。这些结果提示卵巢过表达NGF可以诱导出PCOS的生殖与代谢方面的特征 ， 同时也支持了交感神经过度兴奋是导致 PCOS发生发展的原因之一的假说 。

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